广东梅州柑橘黄龙病和病毒病的发生调查及其黄龙病菌原噬菌体多样性

【目的】调查柑橘黄龙病（Huanglongbing,HLB）和病毒病在广东省梅州市柑橘主产区的危害情况,分析该地区柑橘黄龙病菌（CLas）的原噬菌体多样性。【方法】以16S rDNA为模板设计引物,利用实时荧光定量PCR（qPCR)检测梅州市不同抽检地在2017—2019年3年间柑橘黄龙病的发病情况;同时分别采用已报道的柑橘衰退病毒（Citrus tristeza virus,CTV）、柑橘裂皮病毒（Citrus exocortis viroid,CEVd）、柑橘褪绿矮缩病毒（Citrus chlorotic dwarf-associated virus,CCDaV）、柑橘碎叶病毒（Citrus tatter leaf virus,CTLV）和柑橘黄脉病毒（Citrus yellow vein clearing virus,CYVCV）的特异性检测引物,提取样品的RNA,反转后以样品的cDNA为模板,通过普通PCR的方法分析梅州市抽检地区柑橘病毒病的发生情况。此外,以基于2种原噬菌体类型（SC1和SC2）对应的超变异基因区域设计的2对引物（Lap-TJ-F/Lap-TJ-R1和Lap-TJ-F/Lap-TJ-R2）,运用普通PCR方法分析该地区CLas菌株原噬菌体的遗传多样性。【结果】除2018年9月梅州大浦顺兴公司蜜柚基地的抽检样品外,梅州市其他被检地区均发现CLas。总体来说,梅州市的脐橙CLas检出率为55.3%,蜜柚为61.5%,沙田柚为61.7%。其中2017年采集自平原县大拓镇的蜜柚和沙田柚样品CLas检出率为100%,兴宁市白马镇的蜜柚为100%,沙田柚为80%;其他抽检地区的样品CLas检出率在16.7%—83.3%。虽然梅州市部分地区的检出率较高,但其病原菌的含量并不高,大部分处于柑橘黄龙病发病初、中期,属可防可控阶段;此外,梅州市柑橘病毒的总检出率不高,CTV、CTLV和CYVCV为梅州的主要病毒,CEVd和CCDaV没有检测到。CTV、CTLV和CYVCV在脐橙上的检出率依次为78.9%、7.9%和21.1%,蜜柚为15.4%、25.0%和9.6%,沙田柚为6.4%、2.1%和4.3%。基于Lap-TJ-F/Lap-TJ-R1和Lap-TJ-F/Lap-TJ-R2来研究CLas原噬菌体多样性的PCR扩增条带共有4种类型（SC1-1、SC1-2、SC2-1和SC2-2）,经过PCR电泳和测序得出,来自梅州市脐橙和沙田柚的CLas菌株以SC2-1型为主,蜜柚上以SC1-1型为主。【结论】梅州柑橘产区的柑橘黄龙病目前属于可防可控阶段,其病原菌菌株的原噬菌体在不同品种上具有其独特性;由于在抽检时发现有柑橘病毒病的存在,因此在种植过程中需加强种苗监管,同时应采取有效措施对柑橘黄龙病和柑橘木虱（Diaphorina citri）进行绿色防控。     

草莓白化相关病毒中国分离物全基因组分析

草莓白化相关病毒(strawberrypallidosis-associatedvirus,SPa V)属于长线形病毒科(Closteroviridae)毛形病毒属(Crinivirus),可引起草莓病害,2017年在中国首次报道。采用高通量测序、RACE和RT-PCR技术获得了SPa V中国分离物(FJ)的基因组全长。该病毒含有两条正单链基因组RNA1和RNA2。RNA1全长8 048 nt,5′和3′非编码区序列分别为264和197 nt,含有3个开放阅读框(ORF),分别编码ORF 1a/1b融合蛋白和p9蛋白。RNA2全长7 977 nt,5′和3′非编码区序列分别为248和186 nt,含有8个开放阅读框(ORF),分别编码HSP70h、CPh、CP、CPm、p7、p6、p9和p28等8个蛋白。RNA1和RNA2与美国M1分离物分别具有98.5%和99.0%的核苷酸一致性;系统发育分析结果表明,SPa V中国分离物(FJ)单独处在一个分支。对SPa V来源的小RNA的分析表明,来源于SPa V的小RAN长度以21和22 nt为主。     

狂犬病病毒HEP-Flury M基因重排后在小鼠神经母细胞瘤细胞中的表型分析

【目的】探究狂犬病病毒HEP-Flury M基因重排对基因转录和蛋白表达的影响,揭示病毒在小鼠神经母细胞瘤(NA)细胞中的表型变化与M基因重排的相关性。【方法】通过荧光定量PCR、Western blot以及病毒在NA细胞中的生长和扩散试验,对亲本毒株rHEP-Flury和M基因重排毒株M2、M4在NA细胞中的基因转录、表达、生长和扩散进行比较。【结果】狂犬病病毒结构基因的转录和表达主要受病毒基因组RNA合成的影响,但是在一个完整转录过程中单个结构基因的转录比例与其所在位置相关,M基因重排病毒的Leader RNA (LeRNA)和L mRNA的转录比例显著高于亲本毒株rHEP-Flury。M基因重排病毒在NA细胞中的生长和扩散都劣于亲本毒株rHEPFlury。【结论】狂犬病病毒亲本毒株rHEP-Flury具有狂犬病病毒原始的基因组顺序,在NA细胞中的生长和扩散都明显优于M基因重排病毒。结构基因在基因组中的位置主要决定其在一次转录过程中的转录比例,进而影响病毒在NA细胞中的生长和扩散。     

H9N2禽流感病毒全基因组密码子使用偏好性及影响因素分析

【目的】探究H9N2禽流感病毒(AIV)全基因组的密码子使用偏好性及影响因素。【方法】选取2010—2018年国内H9N2 AIV流行毒株的全基因组为研究对象,分析其碱基组成特性、最优密码子、密码子使用偏好性的影响因素以及病毒对宿主密码子使用模式的适应性。【结果】H9N2 AIV的全基因组中AU含量高于GC。大部分最优密码子以A或U结尾,有效密码子数(ENC)平均值为52.86,提示存在密码子使用偏好性但偏好性较低。密码子使用偏好性主要受到突变压力和自然选择的共同作用,其中自然选择(所占比例为61.79%～76.15%)作用大于突变压力(所占比例为23.85%～38.21%)。H9N2 AIV对人Homo sapiens的密码子适应指数平均值为0.739～0.741,提示H9N2AIV禽流感病毒可能已适应人类的密码子使用模式。【结论】本研究为H9N2 AIV的基因进化分析、已有疫苗的密码子优化和新型疫苗(密码子去优化疫苗)研制提供了理论依据。     

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒株JXA1反向遗传平台的构建

【目的】为高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(Highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus,HP-PRRSV)的结构功能和致病机理的研究奠定基础。【方法】运用反向遗传技术将HP-PRRSV JXA1株的全基因组分段克隆至改造过的低拷贝载体pOKq上,并在病毒基因组两端分别添加CMV启动子和BGH终止信号肽以及在病毒全基因组第510位核苷酸突变引入Fse I酶切位点,作为遗传标记位点。采取基于DNA-launched途径进行病毒拯救,并对拯救的病毒进行生物学特性分析。【结果】构建的PRRSV JXA1毒株的全长cDNA克隆具有感染性;成功拯救了病毒,命名为rJXA1;成功引入了拯救病毒的遗传标记;拯救病毒与亲本病毒的生长曲线相似,二者达到最高滴度的时间均为感染后72 h。【结论】成功构建了JXA1株反向遗传平台,为进一步研究HP-PRRSV的致病机理、基因功能以及新型疫苗研发奠定了基础。     

预处理及培养方法协同作用对新铁炮百合种子萌发的影响

【目的】 研究不同预处理方式下培养方法协同作用对新铁炮百合种子萌发的影响。【方法】 以新铁炮百合雷山1号种子为材料,采用三因素四水平正交试验设计,研究不同水平的预处理方式、培养温度、培养方式对新铁炮百合雷山1号种子萌发的影响,以及不同温度下种子萌发过程中可溶性糖和过氧化物歧化酶(SOD)的动态变化规律。【结果】 培养温度是影响新铁炮百合雷山1号种子萌发的主要因素,其次是预处理方式和培养方式。雷山1号种子的最佳预处理方式是4℃浸种7 d,最佳培养温度是21℃,最佳培养方式是土壤播种,发芽率为99.18%,播种后第9 d发芽指数为4.65。不同温度处理下,种子萌发过程中超氧化物歧化酶(SOD)活性表现出先增加后下降的趋势,可溶性糖含量则呈现出先下降再上升的趋势,其中21℃处理下种子的抗逆性和贮藏物质的转化利用要高于15、18和25℃处理下的种子,21℃为适宜温度。【结论】 雷山1号种子的最佳处理方式为4℃浸种7 d于21℃下土壤播种。     

基于高通量测序的技术检测梨树病毒

【目的】 研究运用基于高通量测序的技术检测梨树病毒,为梨树病毒的检测提供新方法。【方法】 于2014年、2017年、2018年4月中旬采集库尔勒香梨花朵若干,分别进行转录组测序,将得到的序列经过转录本拼接、层次聚类和基因功能注释,筛选出注释为植物病毒的序列作为候选病毒序列。利用RT-PCR方法检测随机采集的香梨枝条样品,验证高通量测序结果的可靠性。【结果】 根据3组转录组测序数据的生物信息学分析结果,分别对注释为来源于植物病毒的66、202和921条基因序列进行分析。3种梨树中已报道的病毒,分别是苹果茎痘病毒、苹果茎沟病毒和苹果褪绿叶斑病毒,以及梨树中未报道的芸薹黄化病毒。采用设计的特异性引物,通过RT-PCR技术对筛选出的4种病毒进行扩增验证,结果扩增出苹果茎痘病毒和苹果茎沟病毒的目的片段。【结论】 高通量测序技术可作为检测梨树病毒的一种快速、有效手段。     

新疆冬小麦品种萌发期耐盐性综合评价及耐盐种质的筛选

【目的】研究不同类型盐胁迫对新疆冬小麦萌发期的影响,并进行耐盐性综合评价,为新疆小麦萌发期耐盐品种的评价和指标筛选提供理论依据。【方法】测定76份新疆冬小麦品种(系)在NaCl和NaCl∶Na₂SO₄两种不同盐胁迫条件下小麦根数、最长根长、苗高、胚芽鞘长度、发芽势、发芽率等6个性状,利用隶属函数法并通过聚类分析分别对两种盐胁迫条件下冬小麦品种(系)的耐盐性进行筛选,综合评价和筛选新疆冬小麦耐盐性。【结果】与对照处理相比,NaCl和NaCl∶Na₂SO₄两种盐胁迫对新疆冬小麦品种(系)各性状均有明显的抑制作用,其中NaCl单盐胁迫对各性状抑制作用比NaCl∶Na₂SO₄混合盐胁迫抑制程度更大。通过NaCl单盐胁迫条件下聚类分析,新疆冬小麦品种(系)按耐盐性强弱可分为高耐型(6个/占供试材料的7.89%)、耐盐型(15个/19.74%)、中耐型(16个/21.05%)、敏感性(18个/23.68%)和高敏感型(21个/27.63%)等5类。NaCl∶Na₂SO₄混合盐胁迫条件下聚类分析,新疆冬小麦品种(系)按耐盐性强弱也可分为高耐型(13个/占供试材料的17.11%)、耐盐型(10个/13.16%)、中耐型(16个/21.05%)、敏感性(26个/34.21%)和高敏感型(11个/14.47%)等5类。获得高耐NaCL单盐胁迫的品种(系)6份,占供试品种的7.89%;高耐NaCl∶Na₂SO₄混合盐胁迫的品种(系)13份,占供试品种的17.11%。【结论】两种盐胁迫条件下,350 mol/L浓度对小麦种子的萌发有抑制作用,NaCl单盐胁迫和NaCl∶Na₂SO₄混合盐胁迫均为高耐型的品种3份,均是自育品种和引进品种分别为石冬8号、洛夫林10号和新冬7号。     

过氧化氢、硼酸、PEG对甜菜种子萌发的影响

为了研究不同引发剂对甜菜种子萌发的影响，为种子引发剂筛选提供依据，本研究利用甜菜种子TD802为试验材料，采用不同浓度不同引发剂组合对甜菜种子进行处理，对发芽势、发芽率、发芽指数、活力指数进行测定。结果显示，处理时间相同时，不同浓度不同组合引发剂的引发效果也有差别。通过不同引发组合比对分析表明，8%过氧化氢和40%PEG组合处理的发芽势最高，5% 过氧化氢处理的发芽率最高，3%过氧化氢和0.01%硼酸组合处理的发芽指数最高，8%过氧化氢和0.01%硼酸组合处理的活力指数最高。     

植物种子脱水耐性的研究现状分析与展望

为了更好的聚类植物种质资源耐贮藏和培育免晒植物新品种，研究植物种子脱水耐性的获得、基因表达、调控机理具有重要的理论指导与实践意义。笔者归纳了植物种子脱水耐性的形成假说、生理基础、脱水耐性差异等，重点分析了种子脱水耐性在全基因组、转录组、蛋白质组方面的分子机理研究，指出运用全基因组学方法系统定位世界范围内不同国家地区的不同类型的品种脱水耐性的遗传多样性和相关基因，挖掘种子脱水敏感的关键基因。